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篇1

2011-06-09收稿；2011-09-04接受

本文系寧夏自然科學(xué)基金（No. NZ1147）資助項目

* E-mail: gaozn@nxu.省略

1 引 言

延胡索酸泰妙菌素（Tiamulin fumarate, TF）是一種半發(fā)酵半合成雙萜類新型動物專用抗生素（結(jié)構(gòu)式見圖1），它通過抑制微生物核糖體內(nèi)感受性細菌蛋白的合成，達到抗菌作用[1]。關(guān)于延胡

圖1 泰妙菌素的結(jié)構(gòu)式

Fig．1 Structure of tiamulin

索酸泰妙菌素的研究已報道的有反相高效液相色譜法（RP-HPLC）[2]、高效液相色譜法（HPLC）[3]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[4]、液相色譜-二極管陣列紫外光譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-DAD-ESI-MS）[5]和電化學(xué)方法[6,7]。而在電化學(xué)方法中主要集中在碳糊電極[6]和修飾碳糊電極[7]上的電化學(xué)研究，但TF在乙炔黑-離子液體復(fù)合修飾玻碳電極上的電化學(xué)行為、電化學(xué)動力學(xué)及電化學(xué)分析方法研究工作尚未見報道。

乙炔黑具有良好的電子傳導(dǎo)性、較大比表面積和較強吸附能力等特性[8]，故被用于化學(xué)修飾電極修飾劑[9]。室溫離子液體（RTIL）是指室溫及鄰近室溫下完全由陰、陽離子組成的液體物質(zhì)[10]，具有電位窗口寬，生物相容性好和離子導(dǎo)電性高，能促進電子傳遞等特點[11]，因此引起了電化學(xué)工作者的極大興趣。

本實驗在前期工作[6,7,12～14]基礎(chǔ)上，將1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽 （[BMIM]PF6） 與AB混合, 制備了乙炔黑-離子液體復(fù)合修飾玻碳電極（AB-ILs/GCE），研究了TF在AB-ILs/GCE上的電化學(xué)行為及電化學(xué)動力學(xué)性質(zhì)，并建立了TF含量的電化學(xué)定量測定方法。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660A電化學(xué)工作站（美國CHI儀器公司）；電化學(xué)測定采用三電極系統(tǒng)：以CHI104 GCE （美國CHI儀器公司）和AB-ILs/GCE為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，CHI115鉑絲為輔助電極。

圖2 不同電極的電化學(xué)阻抗譜圖

Fig．2 Electrochemical impedance spectrum of acetylene black-ion liquid modified glassy carbon electrode （AB-ILs/GCE） （a）, AB/GCE（b） and GCE（c） in a mixture of 1.0 mmol/L K3Fe（CN）6-1.0 mmol/L K4Fe（CN）6 solution. Supporting electrolyte: 0.10 mol/L KCl. The frequency range is 0.1～105Hz.

TF原料藥（寧夏多維泰瑞制藥有限公司，批號：201005041）；TF注射液（贛州百靈動物藥業(yè)有限公司，批號：080402）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIM]PF6，純度99%， 上海成捷化學(xué)有限公司）；實驗用水均為二次蒸餾水。

電化學(xué)測試前于電解池中通入高純氮除氧5 min。本研究所涉及到的電位均為相對于SCE的電極電位，所有電化學(xué)測試均在室溫下進行。

2.2 AB-ILs/GCE制備及電化學(xué)阻抗譜表征

GCE先用0.3

SymbolmA@ m α-Al2O3 拋光至鏡面，用水沖洗干凈。再分別在丙酮和水中超聲清洗2 min， 以除去殘留氧化鋁粉，晾干備用。準確稱取8 mg AB并用微量取樣器移取15

SymbolmA@ L [BMIM]PF6，將二者在研缽中混合研磨約20 min，得到糊狀物，取少許糊狀物均勻涂敷在已處理好的電極表面， 制得AB-ILs/GCE。電化學(xué)阻抗譜可表征電極表面修飾過程中電阻變化信息[15]。以1.0 mmol/L Fe（CN）63

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ 為電化學(xué)探針對GCE （圖2c），AB/GCE（圖2b）和AB-ILs/GCE（圖2a）進行了電化學(xué)阻抗譜測試。由圖2a可知，AB-ILs/GCE在高頻區(qū)出現(xiàn)半圓?。ò雸A弧直徑代表電荷轉(zhuǎn)移電阻），且其電荷轉(zhuǎn)移電阻明顯小于AB/GCE和GCE的電荷轉(zhuǎn)移電阻，表明AB-ILs/GCE上有著較高導(dǎo)電性及較小的電荷轉(zhuǎn)移電阻；而在低頻區(qū)AB-ILs/GCE的直線斜率遠大于AB/GCE和GCE的直線斜率，說明在AB-ILs/GCE上電活性物質(zhì)從溶液擴散到電極表面的電阻減小，擴散速率加快[16]。

3 結(jié)果與討論

3.1 TF伏安行為

在0.10 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 （PBS, pH 6.8），掃描速度50 mV/s及電位窗口0.0～1.2 V的條件下，采用CV研究了1.0

SymbolmA@ mol/L TF在GCE（圖3c），AB/GCE（圖3b） 圖3 TF的循環(huán)伏安圖

Fig．3 Cyclic voltammograms of 1.0×10

Symbolm@@ 6mol/L tiamulin fumarate （TF） at GCE （c）, AB/GCE（b） and AB-ILs/GCE （a） in 0.10 mol/L PBS. Scan rate: 50 mV/s及AB-ILs/GCE（圖3a）上的伏安行為。如圖3c所示，TF在GCE上于0.74 V 處出現(xiàn)一個不可逆氧化峰，氧化峰電流為2.847

SymbolmA@ A；TF在AB/GCE上亦于0.74 V處出現(xiàn)一個不可逆氧化峰，氧化峰電流為4.386

SymbolmA@ A。與GCE相比，TF在AB/GCE的氧化峰電位基本不變，氧化峰電流增大約1.8倍；比較曲線a和曲線b發(fā)現(xiàn)，TF在AB-ILs/GCE的氧化峰電位略有負移，氧化峰電流增大約3倍。此結(jié)果表明，TF電催化氧化反應(yīng)是一個不可逆電極反應(yīng)過程，且AB-ILs/GCE對TF電催化氧化具有良好的催化作用。這可能是由于乙炔黑具有較大的比表面積，為TF的電催化氧化提供了較多的反應(yīng)位點，加速了TF電子交換速率[8]；另外，離子液體的高離子導(dǎo)電性也能夠進一步促進電子傳遞[11]。兩者的協(xié)同作用使AB-ILs/GCE對TF的電化學(xué)氧化具有更好的催化作用。在10～400 mV/s范圍內(nèi)，采用CV研究了掃描速度對TF在AB-ILs/GCE上伏安行為影響。實驗表明，隨掃描速度增加, TF在AB-ILs/GCE氧化峰電位Epa發(fā)生正移，峰電流Ipa增大，且峰電流Ipa與掃描速度平方根（v1/2）呈良好線性關(guān)系，擬合方程為Ipa（

SymbolmA@ A）＝

Symbolm@@ 1.378＋2.778v1/2，R＝0.9962。該結(jié)果表明，TF在AB-ILs/GCE上電化學(xué)氧化是受擴散步驟控制的電極反應(yīng)過程。

3.2 實驗條件的影響

在電位窗口0.0～1.2 V，50 mV/s掃描速度下，分別以0.10 mol/L的KCl，Na2SO4，NaClO4，Na2HPO4-NaH2PO4（PBS, pH 6.8），NaAc-HAc，B-R （Britton-Robinson） 等為支持電解質(zhì)，對5.0×10

Symbolm@@ 5 mol/L TF進行CV測試。實驗表明，在PBS中TF具有良好電化學(xué)行為，因此選用PBS為支持電解質(zhì)。

在pH 2.0～9.5 范圍內(nèi)考察了介質(zhì)pH對TF伏安行為的影響。實驗表明，在pH 2.0～8.0范圍內(nèi)Epa隨pH值增大而負移，其線性方程為Epa＝

Symbolm@@ 1124.60

Symbolm@@ 55.67（mV/pH），R＝0.9985。依據(jù)Ep（mV）＝E.0

Symbolm@@ （59m/n）/pH 得到m/n≈1；已知n＝2[7]，由此計算得到質(zhì)子參與數(shù)m＝2，即TF在AB-ILs/GCE上電化學(xué)氧化過程是2個電子2個質(zhì)子參與的不可逆電化學(xué)氧化過程；在pH 8.0～9.5范圍內(nèi)， Epa隨pH值增加而基本不變。而在pH 2.0～6.0范圍內(nèi)， 氧化峰電流Ipa隨pH值增加而降低； 在pH 6.0～9.5范圍內(nèi)， Ipa基本不變。

3.3 電化學(xué)動力學(xué)

3.3.1 電荷轉(zhuǎn)移系數(shù)α 根據(jù)上述實驗結(jié)果，以Epa對logv作圖，得到GCE及AB-ILs/GCE上Epa-logv關(guān)系，其線性方程分別為Epa （mV）＝63.62 logv＋635.4 （R＝0.9986），Epa （mV）＝149.0 logv＋551.3，（R＝0.9987）。斜率分別為63.62和149.0 mV。

根據(jù)完全不可逆擴散控制過程方程式[17]：

Ep＝（blogv）/2＋C（1）

式中， C為常數(shù)， b為Tafel斜率，b＝2.3RTn（1

Symbolm@@ α）F。 由Epa-logv關(guān)系直線斜率可得b/2，即：b＝2

SymbolvB@ Ep

SymbolvB@ （logv） ， 已知n＝2[7]，因此計算得到α分別為0.77和0.90。

3.3.2 電極反應(yīng)速率常數(shù)kf

平板電極上可逆電化學(xué)反應(yīng)的電流響應(yīng)遵循如下關(guān)系式[18]:

I（t）＝nFAkfC（1

Symbolm@@ 2Ht/π）（2）

H＝kfD1/2Ox＋kbD1/2Rd（3）

對于完全不可逆電極反應(yīng)，kb＝0，H＝kf/D1/2Ox，采用CA可以測得電極反應(yīng)速率常數(shù)kf。由實驗測得TF在GCE及AB-ILs/GCE上的I（t）-t1/2關(guān)系曲線 圖4 穩(wěn)態(tài)電流-時間曲線

Fig．4 Time-dependent steady state currents obtained at AB-ILs/GCE while increasing TF concentration at 0.80 V with a stirring rate of 100 r/min截距分別為5.85×10

Symbolm@@ 4 及 3.21×10

Symbolm@@ 4，計算得到TF在GCE及AB-ILs/GCE上的電極反應(yīng)速率常數(shù)kf分別為8.87×10

Symbolm@@ 2和1.23×10

Symbolm@@ 1s

Symbolm@@ 1。

在相同實驗條件下，利用穩(wěn)態(tài)電流-時間響應(yīng)曲線方法測定了TF在AB-ILs/GCE上的響應(yīng)電流與濃度關(guān)系（圖4），TF電流響應(yīng)信號隨其濃度成比例增長，響應(yīng)時間小于5 s。最低響應(yīng)濃度為0.2

SymbolmA@ mol/L。本方法檢出限低，靈敏度高，可作為TF電化學(xué)定量測定方法。

3.4 電分析方法的應(yīng)用

3.4.1 TF方波伏安行為 在電位窗口0.0～1.2 V及優(yōu)化了的方波實驗條件 （優(yōu)化方波實驗條件：振

圖5 TF方波伏安圖

Fig．5 Square wave voltammogram （SWV） of 1.0

SymbolmA@ mol/L TF at the at GCE （c）, AB/GCE （b） and AB-ILs/GCE （a） in 0.10 mol/L PBS

幅45 mV，方波頻率5 Hz，電勢增量6 mV） 下對1.0

SymbolmA@ mol/L TF進行SWV測試，得到TF 在GCE，AB/GCE及AB-ILs/GCE上的SWV曲線（圖5）。TF在GCE上于0.70 V處出現(xiàn)一個不可逆氧化峰（圖5c），TF在AB/GCE上亦于0.70 V處出現(xiàn)一個不可逆氧化峰（圖5b）。與GCE相比，TF在AB/GCE氧化峰電位不變，氧化峰電流增大約2倍。比較圖5a與圖5b發(fā)現(xiàn)， TF在AB-ILs/GCE上氧化峰電位與AB/GCE上氧化峰電位相比略有負移，氧化峰電流增大2.1倍。此實驗結(jié)果與循環(huán)伏安法所得結(jié)果基本一致，進一步表明AB-ILs/GCE對TF電化學(xué)氧化具有良好的催化作用。

3.4.2 電極重現(xiàn)性和穩(wěn)定性 同一支AB-ILs/GCE電極于5.0×10

Symbolm@@ 5 mol/L TF溶液CV掃描10次，其氧化峰電流RSD為1.9%；平行修飾6次RSD為2.9%，表明制作的修飾電極有良好的重現(xiàn)性。電極在室溫下放置48 h對， TF響應(yīng)電流的變化量在±5%以內(nèi)，表明該電極具有較好穩(wěn)定性，電極壽命為30 d。

3.4.3 干擾實驗 在相同實驗條件下，TF濃度為5.0×10

Symbolm@@ 5 mol/L， 考察了常見離子和葡萄糖、蔗糖對TF催化氧化峰電流影響。實驗結(jié)果表明，1000倍無機離子K.＋，Na.＋，SO2

Symbolm@@ 4，Cl.

Symbolm@@ ，NO.

Symbolm@@ 3和50倍酒石酸、檸檬酸、葡萄糖、蔗糖對TF電流響應(yīng)信號無干擾。

3.4.4 線性范圍及檢出限 在相同實驗條件下用SWV研究了TF氧化峰電流Ipa隨其濃度變化關(guān)系。實驗結(jié)果表明，TF氧化峰電流Ipa與其濃度在0.8～20

SymbolmA@ mol/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性方程為Ipa（

SymbolmA@ A）＝0.74＋0.23C（

SymbolmA@ mol/L）， R＝0.9973；檢出限（S/N＝3）為7.6×10

Symbolm@@ 8 mol/L。

3.4.5 實際樣品測定 取市售延胡索酸泰妙菌素注射液5支，混勻，取適量該溶液置于100 mL容量瓶，用水定容。運用SWV方法對此溶液進行測定，加入已知量TF標準品進行回收率測定，測定結(jié)果見表1。

表1 TF注射液中TF含量及回收率測定結(jié)果（n＝6）

Table 1 Determination results of TF in injection samples（n＝6）

樣品

Samples標示量

Labeled測得值

Found（mg）RSD（%）加入量Added（mg）測得值Found（mg）回收率Recovery（%）

1230.125 mg/支（ampoule）0.1252.20.0630.189101.8

0.1271.10.0750.20198.6

0.1272.90.0880.21599.7

由表1可知，所測得TF樣品的相對標準偏差在1.1%～2.9%，加標回收率在98.6%～101.8%之間，表明本方法精密度和準確度符合定量測定要求。 結(jié)果表明，TF電催化氧化是受擴散步驟控制的電極反應(yīng)過程，且AB-ILs/GCE對TF的電催化氧化具有良好的電催化作用。同時測定了電極過程動力學(xué)參數(shù)，據(jù)此建立了TF電化學(xué)定量測定方法。

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Electrochemical Behaviors and Electrochemical Determination of

Tiamulin Fumarate at Acetylene Black-Ionic Liquid

Modified Glassy Carbon Electrode

CHEN Ji-Wen.1, DUAN Cheng-Qian1,2, GAO Zuo-Ning1,CHEN De-Gang.3

.1（Key Lab of Energy Source and Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering,

Ningxia University, Yinchuan 750021， China）

.2（Higher Vocational College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004， China）

.3（Duowei Tairui Pharmacy Limited Company, Yinchuan 750004， China）

篇2

Effect of Aminopeptidase Inhibitor on Differentiation Induction Activity of All-trans Retinoic Acid in Human Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells and Its Mechanism

Abstract

This study was purposed to investigate whether aminopeptidase inhibitor，bestatin，can potentiate all-trans retinoic acid (ATRA)-inducing differentiation in NB4 cells，and to explore its mechanism. The NB4 cells were exposed to either bestatin and ATRA alone or in combination，the morphological changes of NB4 cells were observed by optical microscopy，the CD11b expression was measured by flow cytometry，the function of defferentiation cells was analyzed by nitroblue-tetrazolium (NBT) reduction assay，the mRNA expressions of c-myc and c-EBPε in NB4 cells were detected by RT-PCR，the c-Myc protein expression was determined by Western blot. The results showed that treatment with bestatin alone induced no significant changes in morphology，NBT reduction activity and CD11b expression in NB4 cells. NB4 cells incubated with 10 nmol/L ATRA plus 100 μg/ml bestatin showed more morphologic feature of metamyelocyte and band neutrophil than ATRA alone treated cells. 100 μg/ml bestatin enhanced the NBT reduction activity in NB4 cells induced by various concentrations of ATRA (10，20，40 nmol/L). The effects of various concentrations of ATRA in combination with 100μg/ml bestatin were statistically different from the effect of ATRA alone (P

Key words bestatin; ATRA; cell line，NB4; differentiation

氨肽酶抑制劑烏苯美司（bestatin）能抑制氨肽酶N/CD13和亮氨酸氨基肽酶活性，通過增強宿主免疫功能及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用［1，2］。有研究提示，bestatin能夠誘導(dǎo)U937細胞的分化［1］，國內(nèi)未見報道。我們以NB4細胞為研究對象，通過形態(tài)、功能和表面分化抗原等多層次實驗研究，了解bestatin是否能誘導(dǎo)NB4細胞分化及（或）對ATRA的誘導(dǎo)分化作用的增強效應(yīng)，并初步探討其可能的機理。

材料和方法

主要試劑

Bestatin、ATRA均購于Sigma公司。bestatin以無菌去離子水溶解為1 mg/ml，分裝之后-20℃保存；ATRA以無水乙醇溶解成10-5 mol/L的儲存液，4℃避光保存，使用時用RPMI 1640細胞培養(yǎng)液將其稀釋為相應(yīng)工作濃度。NBT為BBI公司產(chǎn)品，以PBS配成0.1%溶液，過濾除菌后4℃避光保存，使用前1周內(nèi)配制。RPMI 1640為Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清為JRH公司產(chǎn)品。CD11b-FITC標記單克隆抗體為Teotech公司產(chǎn)品。CD13-PE標記單克隆抗體為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。TRIzoL試劑為Gibco公司產(chǎn)品，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq DNA合成酶為Promega公司產(chǎn)品。鼠抗人c-Myc單克隆抗體（c-33）及羊抗人β-Actin多克隆抗體（I-19）均為Santa Cruz公司產(chǎn)品，使用時以TBST液分別按1∶500和1∶1 000稀釋。ECL顯色液為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

細胞培養(yǎng)及藥物處理

人APL細胞株NB4細胞（浙江大學(xué)腫瘤研究所惠贈）及人髓細胞白血病細胞株HL-60細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天傳代1次。實驗時取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度為7×104/ml，以不同濃度ATRA和bestatin單獨或聯(lián)合處理，于不同時間收集細胞進行實驗。

細胞形態(tài)學(xué)觀察

取空白對照組及藥物處理各組細胞懸液，離心，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，用光學(xué)顯微鏡（Leica，40×10）觀察細胞形態(tài)。

四氮唑藍（nitroblue-tetrazolium，NBT）還原實驗

按文獻［3］報道的方法進行?？瞻讓φ战M及藥物處理各組細胞與NBT共孵育后，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下（100×10）觀察，胞漿內(nèi)含有藍黑色顆粒者為陽性細胞，隨機計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞百分率。

細胞表面分化抗原CD11b和CD13的檢測

取對數(shù)生長期HL-60細胞和NB4細胞或藥物處理后各組NB4細胞離心，用PBS（pH 7.4）洗滌，調(diào)整細胞數(shù)為2×105/50 μl，加CD13-PE標記單克隆抗體8 μl或CD11b-FITC標記單克隆抗體5 μl，避光孵育30分鐘，用PBS洗滌，上流式細胞儀檢測。以Cellquest 1.2軟件進行分析。

細胞總RNA提取和RT-PCR反應(yīng)

總RNA提取 用TRIzoL一步法抽提細胞總RNA，按試劑說明書操作。甲醛變性凝膠電泳證實為完整RNA，紫外分光光度儀定量，A260 nm/280 nm比值均在1.8-2.0之間。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

樣品總RNA 4 μg及隨機引物0.5 μg，70℃ 5分鐘，立即冰浴，離心。依次加5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μl、10 mmol/L dNTP 1.25 μl、M-MLV 200 U，RNase抑制劑0.6 μl，DEPC水補至反應(yīng)體積為25 μl，于27℃10分鐘，37℃ 60分鐘，72℃ 10分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冰浴1分鐘，結(jié)束反應(yīng)。

PCR反應(yīng)

PCR引物為上海Sangon公司合成。引物序列、反應(yīng)條件及產(chǎn)物大小見表1。反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl、10×PCR緩沖液2.5 μl、25 mmol/L MgCl2 1.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、25 μmol/L(c-myc與c-EBPε)或2.5 μmol/L(β-actin)上游及下游引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶1U，用滅菌去離子水補至終體積為25 μl。預(yù)實驗確定產(chǎn)物與循環(huán)之間呈線性關(guān)系范圍。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/ml溴化乙錠）電泳，電場強度5 V/cm，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，用凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司）掃描分析條帶灰度，以目的基因與β-actin的灰度比做半定量分析。Table 1. Sequences of primers，condition of PCR and sizes of PCR products（略）

Western blot

收集藥物處理各組細胞（細胞數(shù)為2×106/ml），預(yù)冷的PBS漂洗2次，重懸于100 μl Lammiulis上樣緩沖液（0.125 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，5%甘油）中，超聲波裂解，于4℃離心13 000×g）15分鐘，收集上清，蛋白樣品保存于-80℃。按蛋白定量試劑盒（Bio-Rad公司）操作說明書進行蛋白定量，在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜以5%脫脂奶粉封閉1小時，分別與抗人c-Myc和抗人β-actin抗體及辣根過氧化酶標記的二抗孵育。ECL顯色，顯影于膠片。圖像分析處理系統(tǒng)（Image Station 2000R）掃描，測定條帶的面積和灰度，以二者之乘積進行半定量比較分析。

統(tǒng)計學(xué)分析處理

各項實驗重復(fù)3次以上，以X±D表示，多組間比較F檢驗后采用方差分析及Tukey檢驗。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

結(jié)果

NB4細胞表面有CD13的表達

NB4細胞CD13陽性表達率為94.79%（平均熒光強度為1739.59），對照組HL-60細胞CD13陽性表達率為95.49%（平均熒光強度為3107.49）。兩者的CD13平均熒光強度有一定的差異，但陽性百分率差異不明顯。

Bestatin與ATRA聯(lián)合處理后NB4細胞形態(tài)改變明顯

100 μg/ml bestatin單獨作用72小時后，NB4細胞形態(tài)無明顯改變。10 nmol/L ATRA單獨作用72小時后，NB4細胞呈現(xiàn)部分分化的形態(tài)，細胞核/漿比例減小，核變小有凹陷。100 μg/ml bestatin與10 nmol/L ATRA聯(lián)合處理72小時后，NB4細胞形態(tài)分化更加明顯，細胞漿內(nèi)空泡增多，核凹陷、扭曲更加明顯，形態(tài)似晚幼粒及桿狀核粒細胞的細胞增多（圖1）。

Bestatin與ATRA聯(lián)合應(yīng)用后NB4細胞NBT還原能力明顯增加

以一定濃度（50、75和100 μg/ml）bestatin單獨處理72小時后，NB4細胞的NBT還原能力無明顯改變（與空白對照組相比較，P>0.05）；不同濃度（10、20和40 nmol/L）ATRA作用72小時后，NB4細胞的NBT還原能力呈濃度依賴性增加，與空白對照組相比，差異明顯。100 μg/ml bestatin與不同濃度ATRA聯(lián)合處理72小時后，NB4細胞的NBT陽性率明顯地提高，與單用相應(yīng)濃度ATRA組相比，差異顯著（表2）。Table 2. Effect of bestatin on the NBT reduction activity of NB4 cells induced by ATRA. (略)

100 μg/ml bestatin單獨處理細胞不同時間（48小時-96小時），NB4細胞的NBT還原能力改變不明顯（與相應(yīng)時間點空白對照組相比，P>0.05）；10 nmol/L ATRA處理細胞至72小時，開始出現(xiàn)NB4細胞NBT還原能力的增強，并呈時間依賴性，與相應(yīng)時間點對照組相比，有明顯差異；而10 nmol/L ATRA與100 μg/ml bestatin聯(lián)合處理48小時，就出現(xiàn)NB4細胞NBT還原能力的明顯增強，且此作用隨時間延長而明顯增強，與相應(yīng)時間點單用10 nmol/L ATRA組相比，差異顯著（圖2）。

Bestatin與ATRA聯(lián)合處理后NB4細胞CD11b表達明顯增強

100 μg/ml bestatin單獨處理72小時后，NB4細胞CD11b陽性表達率（MFI為13.4±0.6）稍有增加，但與對照組（MFI為12.3±0.9）相比，差異不顯著（P>0.05）。10 nmol/L ATRA單獨處理72小時之后，NB4細胞CD11b陽性表達率（MFI為19.2±4.2）明顯提高，與對照組相比，差異顯著（P

Bestatin和ATRA單獨及聯(lián)合處理后NB4細胞c-EBPε mRNA表達的變化

NB4細胞低表達c-EBPε mRNA。10 nmol/L ATRA處理12小時之后，NB4細胞c-EBPε mRNA表達水平明顯提高，與對照組相比較，差異顯著(P

Bestatin和ATRA單獨及聯(lián)合處理后NB4細胞c-myc表達的變化

NB4細胞c-myc mRNA呈高水平表達。10 nmol/L ATRA單獨處理4小時后，NB4細胞c-myc mRNA表達下降，與空白對照組相比較，差異明顯（P

Figure 4. Effect of bestatin and ATRA on the expression of c-myc mRNA of NB4 cells after treatment for 4 hours. M: marker; Lane 1: control. Lane 2: bestatin (100 μg/ml). Lane 3: ATRA (10 nmol/L). Lane 4: bestatin (100 μg/ml) +ATRA (10 nmol/L).

NB4細胞c-Myc蛋白呈高表達。10 nmol/L ATRA單獨處理8小時后，NB4細胞c-Myc蛋白表達水平明顯下降（P

討 論

ATRA對APL的有效治療是白血病誘導(dǎo)分化治療的成功典范。但單用ATRA治療易復(fù)發(fā)及產(chǎn)生耐藥，與其他化療藥物聯(lián)用時療效有一定的提高，但毒副反應(yīng)增加。因此，尋找能夠增強ATRA誘導(dǎo)分化作用而毒副反應(yīng)輕的藥物，成為臨床治療中的關(guān)注問題之一［7，8］。最近，Hirano等［7］根據(jù)NBT還原實驗結(jié)果提出，bestatin可能增強ATRA對NB4細胞的誘導(dǎo)分化作用，但未做進一步的研究。本研究通過對細胞形態(tài)、功能和表面分化抗原等多層次的檢測及分析對比，表明一定濃度范圍的bestatin本身不能誘導(dǎo)NB4細胞分化，但確能增強ATRA對NB4細胞的誘導(dǎo)分化作用。

Hirano等［7］認為，bestatin增強ATRA誘導(dǎo)分化作用可能與其抑制細胞表面CD13活性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與HL-60細胞相似，NB4細胞表面CD13陽性表達率高達94.79%，該藥是否通過抑制CD13表達從而增強ATRA誘導(dǎo)NB4細胞分化的作用，尚待進一步研究證實。髓系祖細胞定向分化受轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)。ATRA調(diào)節(jié)與髓細胞定向分化有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達誘導(dǎo)APL細胞向中性粒細胞分化。氨基肽酶N/CD13為Ⅱ型跨膜蛋白，胞內(nèi)端只有8-10個氨基酸，但最近研究報道，CD13分子能夠直接參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程［9］。因此，本研究從藥物對轉(zhuǎn)錄因子影響的角度對氨肽酶、抑制劑bestatin增強ATRA誘導(dǎo)分化作用的可能機制進行了初步探索。c-EBPε為C-EBP家族轉(zhuǎn)錄因子之一，ATRA誘導(dǎo)NB4細胞向中性粒細胞方向分化時，藥物作用2小時，c-EBPε mRNA表達水平即開始增高，并持續(xù)增高至細胞終末分化［10］。而酪氨酸激酶抑制劑STI571增強ATRA誘導(dǎo)NB4細胞向中性粒細胞分化時，c-EBPε基因及蛋白的表達水平均未進一步增高［8］。本研究結(jié)果顯示，10 nmol/L ATRA處理12小時后，NB4細胞c-EBPε mRNA表達水平明顯上升，而100 μg/ml bestatin與ATRA聯(lián)合處理NB4細胞時，c-EBPε mRNA表達卻未進一步增強。這提示bestatin可能與STI571相似，其增強ATRA對NB4細胞的誘導(dǎo)分化作用可能不是通過調(diào)節(jié)c-EBPε表達。

原癌基因c-myc表達異常與髓細胞性白血病的發(fā)生有關(guān)，抑制c-myc表達可以促使白血病細胞分化及誘導(dǎo)細胞終末分化后的凋亡。本研究結(jié)果顯示，10 nmol/L ATRA單獨作用能夠使NB4細胞c-myc的表達下調(diào)，這與文獻報道相似［11］。同時，bestatin與ATRA聯(lián)合應(yīng)用時c-myc表達水平的下調(diào)作用較單用ATRA時更加明顯，且藥物聯(lián)合應(yīng)用各組細胞的c-myc蛋白表達水平與藥物誘導(dǎo)的NBT還原能力之間呈明顯的負相關(guān)。這提示bestatin可能通過與ATRA協(xié)同下調(diào)c-myc表達，從而增強ATRA誘導(dǎo)NB4細胞分化的作用。1，25-(OH)2 D3在誘導(dǎo)HL-60細胞分化時，激活蛋白激酶C，引起c-myc表達下調(diào)［12］。bestatin是否也通過激活蛋白激酶C增強ATRA下調(diào)c-myc的表達，這有待進一步研究證實。

【參考文獻】

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3韓銳. 抗癌藥物研究與實驗技術(shù). 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997： 329-330

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8Gianni M，Kalac Y，Ponzanelli I，et al. Tyrosine kinase inhibitor STI571 potentiates the pharmacologic activity of retinoic acid in acute promyelocytic leukemia cells: effects on the degradation of RAR alpha and PML-RAR alpha. Blood，2001; 97: 3234-3243

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